Mi az a polimeráz láncreakció (pcr)? tények a tesztről, lépésekről és felhasználásra

Mi a PCR (polimeráz láncreakció)?

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan módszer, amelyet szinte bármilyen folyadékban vagy felületen vagy a felületen elhelyezkedő DNS (és egyes esetekben RNS) sokaságának amplifikálására használnak, ahol a DNS-szálak lerakódhatnak. A PCR megértésének kulcsa az, hogy tudjuk, hogy minden ember, állat, növény, parazita, baktérium vagy vírus genetikai anyagot tartalmaz, például DNS (vagy RNS) szekvenciákat (nukleotid szekvenciák vagy DNS vagy RNS darabok), amelyek a fajukra egyediek, és a faj egyes tagjai számára. Következésképpen, ha egy minta DNS vagy RNS szegmenseket tartalmaz, a PCR egy módszer, amely ezen egyedi szekvenciák amplifikálására (sokkal azonos azonos példányok készítésére) szolgál, így ezek felhasználhatók nagyon nagy valószínűséggel a forrás azonosságának meghatározására (a az anyag szinte bármilyen mintájában vagy annak felületén található nyoma-DNS vagy RNS specifikus személy, állat vagy kórokozó szervezet).

A PCR amplifikáció azonban csak az azonosító teszt része. Miután az amplifikáció megtörtént (lásd alább), az amplifikált szegmenseket összehasonlítani kell egy ismert forrásból származó más nukleotid szegmensekkel (például egy adott ember, állat vagy kórokozó szervezet). Az egyedi szegmensek összehasonlítását gyakran úgy hajtják végre, hogy a PCR-rel előállított nukleotidszekvenciákat az emberek, patogének vagy más források ismert nukleotidszekvenciáinak elhelyezésével elválasztó gélbe helyezik. Az elektromos áramot átvezetik a gélen, és a különböző nukleotidszekvenciák olyan sávokat képeznek, amelyek elektromos töltésük és molekuláris méreteik szerint "létrára" hasonlítanak. Ezt gél-elektroforézisnek nevezzük. A sávok vagy a "létrák", mint a lépések, amelyek ugyanazon a szintre vándorolnak a gélben, a nukleotidszekvenciák azonosságát mutatják. Ez a módszer az egyik legnépszerűbb módszer a PCR-tesztek elvégzéséhez (lásd 1. ábra).

1. ábra, Sávok vagy "létra", mint a Mycobacterium PCR-termelő DNS-lépései (a CDC hozzájárulásával)

Ábra. Ismétlődő elem (Rep) –PCR (A) és impulzusmezős gélelektroforézis (PFGE) (B) minták a Mycobacterium cosmeticum izolátumokból 2-ból Ohio-ban és 1-ből Venezuelában. A rep-PCR-t BOXA1R primer (3) alkalmazásával hajtottuk végre, a PFGE-t az AseI restrikciós enzimmel végeztük. 1., 2. sáv, Ohio az OH1 és OH2 izolátumát; 3., 4. sáv, ATCC BAA-878T és ATCC BAA-879 kontroll törzsek; 5. sáv, venezuelai izolátum VZ1. A DNS méret-standardjai 100 bp (S1) és 48, 5 kb méretű marker (S2).

Hogyan történik a PCR (polimeráz láncreakció)?

1983-ban Kary Mullis kitalálta a DNS-szekvenciák amplifikációjának alapvető lépéseit. Őt és Michael Smith-t 1993-ban Nobel-díjjal jutalmazták az eljárás kidolgozásáért. Van néhány alapvető lépés, amelyeket egymás után követnek; A PCR egyetlen csőben, megfelelő vegyszerekkel és egy speciálisan kialakított fűtőberendezéssel elvégezhető. A szükséges reagensek vagy vegyi anyagok a következők:

• Nukleotidszekvenciát tartalmazó minta (vérből, hajból, gennyből, bőrkaparásból stb.)
• DNS primerek: rövid egyszálú DNS, amely nukleotidszekvenciához kapcsolódik, és elősegíti a nukleotidok komplementer szálának szintézisét
• DNS-polimeráz: olyan enzim, amely, ha a DNS-hez kötõdött egy láncindító, lemegy a DNS-szegmenseken, amelyhez DNS-építőelemeket kapcsol, komplementer bázispárokat képezve, és így szintetizálja a DNS komplementer nukleotidláncát (hőálló DNS-polimeráz bevezetése, Taq hőálló baktériumokból származó polimeráz, amely jelentősen javította a PCR elvégzésének képességét)
• Nukleotidoknak nevezett DNS-építőelemek nagy többlete (adenin, timidin, citozin és guanin, rövidítve: A, T, C és G) jelen van az oldatban. Amikor ezek a blokkok egymással kapcsolódnak, nukleotidszekvenciát vagy egyetlen DNS-szálot képeznek. Amikor ezek az építőelemek gyenge hidrogénkötésekkel kötik össze komplementer építőköveiket (például A csak T-vel kötődik és G csak C-vel), komplementer DNS nukleotid szekvencia jön létre, és az eredeti egyszálú DNS-hez kötődik. Amikor a kötés befejeződik, egy komplementer kettős szálú DNS alakul ki egy specifikus szekvenciában.

A PCR ezután egy mintának a DNS szegmensével kezdődik, amelyet egy csőbe helyeznek a fent felsorolt ​​reagensekkel. Az oldatot legalább 94 ° C-ra melegítjük. ez a hő megszakítja a hidrogénkötéseket, amelyek lehetővé teszik a komplementer DNS-szálak kialakulását, így csak az egyszál létezik a keverékben (ezt kettős szálú DNS denaturációjának nevezik).

Az elegyet hagyjuk lehűlni körülbelül 54 ° C-ra (129, 2 F). Ezen a hőmérsékleten a DNS-láncindítók és a DNS-polimeráz az egyedi egyszálú DNS-hez kötődik (ezt a DNS lágyulásának nevezzük). Mivel az építőelemek fölöslegben vannak (magas koncentrációban) a keverékben, a polimeráz azokat felhasználja új DNS komplementer szálak előállítására (a DNS kiterjesztésének nevezzük), és ez a folyamat 72 ° C-on (161, 6 F) gyorsabb. Ez a folyamat új, kettős szálú DNS-molekulát hoz létre az eredeti molekula egyes szálaiból.

Ezt a ciklust körülbelül 40-szer megismételjük egy olyan hőkezelő készüléknek nevezett gépen, amely automatikusan megismétli a fűtési-hűtési ciklusokat, és az egyes DNS-szekvenciák mennyisége megkétszereződik a fűtési-hűtési ciklus befejezésekor. Ami eredetileg egyetlen rövid DNS-szegmens volt, 40 megduplázódási ciklus után mintegy 100 milliárd példányra amplifikálható.

Miért rendelne egy orvos PCR (polimeráz láncreakció) tesztet?

A PCR-teszt számos olyan vizsgálat alapját képezi, amely számos különféle orvosi kérdésre választ adhat, amelyek segítenek az orvosoknak a betegek diagnosztizálásában és kezelésében. Például a PCR-teszt képes kimutatni és azonosítani a kórokozó szervezeteket a betegekben, különösen azokat, amelyeket nehezen lehet megtermelni (például HIV és más vírusok és egyes gombák).

Más orvosok PCR-teszteket rendelnek a genetikai betegségek diagnosztizálására, míg más orvosok a PCR-t használják biológiai kapcsolatok kimutatására, például a gyermekek szüleinek azonosítására. A PCR-teszteket arra is használják, hogy azonosítsák és jellemezzék az egyes daganatokban előforduló genetikai mutációkat és átrendeződéseket.

A PCR-teszteket azonban módosították és kiterjesztették a tudományos vizsgálatok sok aspektusára, beleértve az evolúciós biológiát, a genetikai ujjlenyomatot, a kriminalisztikai vizsgálatokat és még sokan mások.

Mi az RT-PCR?

Az RT-PCR egy PCR-teszt, amelyet az RNS kimutatására és mérésére terveztek. Bár a kezdeti PCR-tesztek amplifikálták a DNS-t, sok vírus és más biológiai komponens (például a mitokondriumok) az RNS-t használják genetikai anyagként. Az RT-PCR abban különbözik a szokásos PCR-től, hogy először RNS-t vesz fel, és az RNS-szálat DNS-szálrá konvertálja. Ez lényegében a fentiekben ismertetett módszerrel történik a PCR-rel, azzal a különbséggel, hogy a DNS-polimeráz helyett egy fordított transzkriptáznak nevezett enzimet alkalmazunk. A reverz transzkriptáz lehetővé teszi az RNS egyszálú transzlációját a DNS komplementer szálává. Amint ez a reakció megtörténik, a rutin PCR-módszer felhasználható a DNS amplifikálására. Az RT-PCR-t számos RNS-vírus kimutatására és tanulmányozására használták.

Az RT-PCR-t nem szabad összekeverni a PCR egy másik változatával, azaz valósidejű PCR-nek. A valós idejű PCR egy olyan PCR-változat, amely lehetővé teszi az amplifikált DNS elemzését az eljárás szokásos 40 ciklusa alatt. Noha az eljárás hasonló a ciklikus ciklikus szokásos PCR-hez, a valós idejű PCR fluoreszcens festékeket használ fel egyes építőelemekhez vagy kis nukleotid szálakhoz. Az alkalmazott módszertől függően az amplifikált DNS-szálak kialakulásakor fluoreszcencia fordul elő. A fluoreszcencia mennyiségét meg lehet mérni a 40 ciklus során, és ez lehetővé teszi a vizsgálók számára, hogy megmérjék az egyes termékeket és azok mennyiségét az amplifikációs ciklusok során. Ez gyakran lehetővé teszi a vizsgálóknak vagy laboratóriumi technikusoknak, hogy kihagyják a gél-elektroforézist vagy más másodlagos eljárást, amely a PCR termékek elemzéséhez szükséges, így gyorsabb eredményeket hozva.

A valós idejű PCR és az RT-PCR az eredeti PCR teszt variációi vagy módosításai. Sokkal több változat van (legalább 25), amelyek léteznek, és amelyeket speciális problémák megoldására használnak. Mindegyiküknek más neve van, mint például az Assembly PCR, a Hot-Start PCR, a Multiplex PCR, a szilárd fázisú PCR és még sokan mások.

A PCR valószínűleg továbbra is módosul, hogy segítsen megválaszolni minden egyéb kérdést az orvostudományban, a biológiában. és egyéb tanulmányok.